Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

Количественная цитометрия – относительно новая методика микробиологического исследования дисперсионных сред, проводимая с помощью специального оборудования. Цитометрия бывает статической и проточной.

Статическая цитометрия проводится с использованием конфокальных микроскопов; при их отсутствии в ход идут слегка модифицированные люминесцентные микроскопы, оснащенные простыми и дешевыми системами анализа изображений.

Проточная цитометрия осуществляется на специальных аппаратах – сортерах и проточных цитрометрах.

Оба варианта количественной цитометрии имеют широчайшие возможности применения в практике медицинских и биологических исследований. Несмотря на разность используемого клинического материала и экспериментальных моделей решаемые ими задачи подчиняются общим принципам исследования.

Что такое проточная цитометрия?

Проточной цитометрией называют методику исследования дисперсионных субстанций в режиме поштучного анализа частиц, входящих в состав дисперсной фазы по сигналам, получаемым в ходе флуоресценции и рассеивания света.

Название методики точно отражает сущность обозначаемого процесса, состоящего в исследовании потока одиноких биологических частиц.

Методика проточной цитометрии была создана на базе специальных экспериментов по определению размера исследуемых частиц и подсчету их количества.

Первый клеточный сортер был создан в 1965 году, а с начала следующего десятилетия был налажен выпуск приборов, предназначенных для измерения интенсивности флуоресценции при нескольких длинах волн с целью определения сразу нескольких параметров изучаемых клеток.

Современные исследователи для осуществления проточной цитометрии используют приборы двух типов:

• Приборы, предназначенные для измерения флуоресценции при двух (и более) длинах волн и рассеивании света под углом в десять (так называемом малоугловом прямом рассеивании) и девяносто градусов. Приборы этого типа отличаются простотой использования.
• Довольно громоздкие клеточные сортеры, способные измерить более пяти параметров исследуемых ядер или частиц, а также отсортировать клетки, обладающие определенным набором параметров.

Устройство современных проточных цитометров настолько сложно и разнообразно, что с трудом поддается какому-либо обобщению и систематизации, однако несколько общих моментов, характерных для всех приборов, все же существует:

• Для проведения анализа на цитометре любого типа требуется гомогенная суспензия клеток определенного типа.
• Не должно быть недостатка в количестве исследуемых клеток или их ядер.
• Чтобы не допустить слипания клеток, исследователь должен обладать всей полнотой информации о характере рассеивания света и иметь под рукой таблицы с соответствующими данными.

Мнение врачей:

Проточная цитометрия – это современный метод анализа клеток, который позволяет идентифицировать и изучать их свойства с высокой точностью и скоростью. Врачи отмечают ряд преимуществ данного метода, включая возможность анализа большого количества клеток за короткое время, высокую чувствительность и специфичность результатов, а также возможность одновременного изучения нескольких параметров клеток. Проточная цитометрия широко применяется в онкологии для диагностики и мониторинга опухолевых заболеваний, в иммунологии для изучения иммунных ответов организма, а также в гематологии, микробиологии и других областях медицины. Этот метод является важным инструментом для исследования клеточных процессов и помогает врачам принимать обоснованные решения по диагностике и лечению пациентов.

https://www.youtube.com/embed/UYo36x4jBJM

Образцы

В ходе медицинских и биологических исследований изучаются образцы, приготовленные из клеток:

• костного мозга;
• крови;
• спинномозговой жидкости (ликвора);
• синовиальной (суставной) жидкости;
• плевральной жидкости;
• перитонеальной (асцитической) жидкости, накапливающейся в брюшной полости в процессе развития асцита;
• опухолевых и здоровых тканей.

Принцип метода проточной цитометрии

Принципы, заложенные в основу процедуры цитометрии, чрезвычайно просты.

Суспензия, приготовленная из клеток, предварительно помеченных флуоресцирующими моноклональными антителами или флуорохромами, помещается в поток дисперсионной среды, пропускаемый через проточную ячейку.

Гидродинамическое фокусирование струи клеточной суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому, что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются поодиночке и в таком порядке пересекают пучок сфокусированных световых (обычно лазерных) лучей.

Под воздействием определенных световых волн происходит одновременное возбуждение молекул разных флуоресцирующих красителей, что делает возможным анализ сразу нескольких параметров клеточных структур.

Свет, исходящий от флуорохромов, фокусируют при помощи оптической системы, состоящей из нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты.

Полученные световые сигналы подвергают анализу и преобразованию в электрические импульсы, а затем – в определенные формы, приемлемые для компьютерной обработки и хранения полученной информации.

https://www.youtube.com/embed/jhYsa_l95M8

Опыт других людей

Проточная цитометрия – это современный метод анализа клеток, который позволяет исследовать их физические и химические свойства. Люди отмечают ряд преимуществ этого метода, включая высокую точность и скорость анализа, возможность изучения различных параметров клеток одновременно, а также способность выявлять редкие клеточные подпопуляции. Проточная цитометрия находит широкое применение в медицине, науке и биотехнологии. Она используется для диагностики заболеваний, мониторинга иммунного ответа, исследования клеточной популяции и многих других областей. В результате, этот метод становится неотъемлемой частью современной биомедицинской практики.

Флуорохромы

Для того чтобы облегчить процесс определения клеточных структур в ходе процедуры проточной цитометрии, используемую дисперсионную среду подкрашивают специальными флуоресцирующими красителями – флуорохромами.

После такой обработки исследуемые клетки приобретают способность флуоресцировать (светиться) под воздействием пучка световых лучей.

При выборе того или иного красителя пользуются целым рядом критериев:

• Используемый флуорохром должен быть специфичным по отношению к исследуемой ДНК.
• Спектральные характеристики красителя должны соответствовать возможностям используемой аппаратуры.
• Немаловажным фактором является стоимость флуорохрома (она не должна быть очень высокой).
• Используемые красители должны быть удобны в работе (обладать стабильностью и хорошей растворимостью).

Одним из самых востребованных флуорохромов является йодистый пропидий: его спектральные характеристики идеально подходят для выполнения проточной цитометрии.

Чтобы активизировать флуоресценцию, используя йодистый пропидий, исследователи прибегают к помощи обычного аргонового лазера (рабочая длина его волны составляет 480 нм). Площадь флуоресцирующего участка такова, что позволяет использовать вышеозначенный флуорохром для выполнения многопараметрических измерений.

Для проведения проточной цитометрии также используют:

• изотиоцианат флуоресцеина;
• фикоэритрины (Су5, Су7, техасский красный);
• аллофикоцианин;
• Перидинин-Хлорофилл Протеин.

В качестве флуорохромов могут использоваться также флуоресцирующие моноклональные антитела.

Вне зависимости от того, какой именно краситель принимает участие в процедуре, его количество должно быть прямо пропорционально содержанию ДНК в структуре клетки.

Чтобы добиться качественного прокрашивания всех клеточных структур, количество применяемого флуорохрома должно быть избыточным.

Большинство флуорохромов, вступающих в контакт с ДНК, не способно пройти сквозь мембраны неповрежденных (интактных) клеток. Для повышения проницаемости клеточных мембран исследуемые клетки обрабатывают поверхностно-активными веществами (детергентами) или спиртом.

https://www.youtube.com/embed/1r9OYan7Hzs

Преимущества

Несомненными преимуществами проточной цитометрии можно считать:

• Высокую (до ста тысяч эпизодов в секунду) скорость выполнения анализа.
• Возможность определения клеточных субпопуляций.
• Способность выполнить анализ огромного (до 10⁸ элементов в одном мл дисперсионной среды) количества клеток.
• Возможность определения параметров любых клеток и клеточных структур (в том числе и редко встречающихся).
• Высокую степень объективности в измерении интенсивности свечения (флуоресценции).

Где применяется?

Спектр применения проточной цитометрии необыкновенно широк. Она применяется даже в индустрии, для контроля производственного процесса. Продемонстрируем это, для наглядности представив информацию в виде списков.

В онкологии

В этом разделе медицины проточную цитометрию применяют с целью:

• количественного анализа внутриклеточных структур (ДНК);
• исследования основных параметров клеточного цикла;
• идентификации и подсчета клеток, относящихся к разным периодам клеточного цикла;
• обнаружения анеуплоидных клонов (аномальных клеток с нестандартным набором хромосом), свидетельствующих о развитии острого лейкоза;
• выявления степени пролиферативной активности (тенденции к активному делению) анеуплоидных клонов;
• обнаружения опухолевых маркеров;
• наблюдения за состоянием пациентов, находящихся в группе риска;
• оценки функционирования иммунной системы и функциональной состоятельности иммунных клеток;
• выявления субпопуляций лимфоцитов (эта характеристика позволяет оценить состояние иммунитета).

Видео о методе проточной цитометрии в диагностике острых лейкозов:

Иммунологии

Метод проточной цитометрии позволяет:

• осуществить иммунофенотипирование (определить тип и функциональное состояние) клеток крови;
• установить фагоцитарную активность иммунных клеток (об этом свидетельствует захват бактерий, помеченных флуоресцирующими красителями);
• идентифицировать внутриклеточные белки;
• определить степень пролиферативной активности;
• исследовать стадии клеточного цикла;
• оценить степень цитотоксичности (защитного механизма, позволяющего на внутриклеточном уровне уничтожать простейшие организмы, бактерии и вирусы) клеток.

Цитологии

Проточная цитометрия дает исчерпывающие данные, позволяющие:

• безошибочно установить цитоморфологические характеристики любой клетки (ее размеры, уровень асимметричности, соотношение между ядром и цитоплазмой);
• оценить активность ферментов, входящих в состав клетки;
• проанализировать стадии клеточного цикла;
• измерить физиологические внутриклеточные параметры (уровень pH, потенциал клеточной мембраны, концентрацию свободных ионов).

Гематологии

С помощью проточной цитометрии гематологи могут:

• проанализировать субпопуляционный состав кровяных клеток;
• подсчитать количество ретикулоцитов и тромбоцитов с помощью специфических маркеров;
• оценить последствия резидуальной (остаточной, не до конца излеченной) болезни;
• диагностировать острый лейкоз;
• выполнить дифференциальную диагностику реактивного лимфоцитоза и лимфопролиферативных болезней (недугов, при которых поражаются клетки, имеющие лимфоидную природу);
• осуществить диагностику заболеваний лимфопролиферативной этиологии.

Фармакологии

Проточная цитометрия помогает фармакологам:

• установить уровень экспрессии (чувствительности опухолей разных локализаций к лечению лекарственными препаратами) белковых маркеров;
• измерить активность ферментов, входящих в состав клеток;
• занимающимся изучением действия биоактивных веществ на состояние клеток человеческого организма, определить любую стадию клеточного цикла.

Сельском хозяйстве

Метод проточной цитометрии активно используется учеными, специализирующимися на селекции новых видов растений и выведении пород домашнего скота, поскольку она позволяет:

• определить плоидность (количество одинаковых хромосомных наборов в ядрах) клеток;
• произвести анализ любой стадии клеточного цикла;
• выполнить анализ содержимого протопластов (бактериальных или растительных клеток), а также произвести их сортировку в соответствии с заданными параметрами.

Частые вопросы

Для чего применяют метод проточной цитометрии?

Методы проточной цитометрии чаще всего применяется при исследовании периферической крови человека, в частности лейкоцитов. Также можно исследовать диссоциированные клетки любых тканей, дрожжевые клетки, бактериальные клетки, микропланктон, флуоресцентные микросферы с зондами.

Что такое Цитометрия крови?

Что это такое? Проточная цитометрия — способ исследования качества и количества клеток, которые по одной штуке проходят через узкий капилляр. Для этого клетки помечаются флюоресцентными антителами или антигенами. Оборудование для такого исследования называется цитометром.

Что показывает анализ на Иммунофенотипирование?

Исследование крови и костного мозга на иммунофенотипирование – один из наиболее точных методов диагностики, с помощью которого обнаруживают и квалифицируют различные заболевания, подтверждают диагноз. Также данный способ позволяет определить наиболее удачную схему лечения.

Что такое Изотипический контроль?

Изотипический контроль – выступающее отрицательной контрольной пробой антитело, которое не может вступать в реакцию с представляющим интерес антигеном и имеет тот же изотип, что и испытуемое антитело.

Полезные советы

СОВЕТ №1

Изучите основные принципы работы проточной цитометрии, чтобы понимать, как метод функционирует и какие возможности он предоставляет.

СОВЕТ №2

Ознакомьтесь с областями применения проточной цитометрии, такими как медицина, биология, фармакология, исследования клеточных популяций и т.д., чтобы понять, где и как можно применять этот метод.

СОВЕТ №3

Используйте проточную цитометрию для анализа клеток в вашем исследовании или работе, чтобы получить более точные и детальные данные о клеточных популяциях.